Инжиниринг метаболических путей – это многоотраслевая область, позволяющая использовать микробные клетки на пользу человеку. Концепция заключается в применении технологий манипулирования микроорганизмами для создания ряда необходимых биомолекул из любых источников углерода. Например, субстрат глюкозы можно преобразовать в большое количество продуктов, таких как энзимы, белки, пептиды, витамины, аминокислоты и органические кислоты, а также биотопливный этанол и водород. Ряд возможностей превращают эту дисциплину в новый стандарт для начала эффективного производства биопродуктов…

Инжиниринг «нового стандарта»
Инжиниринг метаболических путей включает в себя направленное изменение физиологии клеток посредством введения, удаления и/или модификации метаболических путей в клетке на основе понимания физиологии клетки в тех условиях, в которых она будет использоваться во время процесса коммерческого производства. Данный подход обычно требует вовлечения ряда дисциплин, в том числе биохимии, молекулярной биологии, химической технологии и вычислительных наук.
На нынешнем уровне развития микроорганизмы могут поддерживать популяцию в рамках своей среды обитания, участвуя в процессе, целью которого никогда не было перепроизводство биопродуктов, применяемых в промышленности. Трудность состоит в том, чтобы превратить микроорганизмы в организмы, предназначенные для одной цели - максимально эффективное преобразование субстрата в продукт во время экономически целесообразного процесса производства. В первую очередь необходимо определить лучший способ преобразования субстрата в нужный продукт. После того, как этот способ будет найден, первой стадией процесса становится клонирование нужных генов в производственную матрицу и удаление (ослабление) вредоносных генов. Объем производства нужной молекулы оптимизируется посредством тонкой настройки экспрессии генов или удаления транскрипционных/аллостерических регуляторных механизмов. Для увеличения выхода продукции используются следующие методы: расширение воздействия осуществленных действий за пределы центрального метаболизма; определение/смягчение этапов, ограничивающих скорость процесса; а также предотвращение потерю углерода в конкурирующих реакциях. Специалисты по молекулярной биологии/биохимии разрабатывают микроорганизм, а химики-технологи оптимизируют процесс производства. Их общей целью является максимальное преобразование субстрата в нужный продукт, создание процесса, из которого можно извлечь выгоду.

1,3-пропандиол (PDO) из глюкозы
Ранее инжиниринг метаболических путей использовался для создания микроорганизма E. coli, который требовался при производстве 1,3-пропандиола (PDO) из глюкозы. Компания Genencor International в сотрудничестве с DuPont использовала метод инжиниринга метаболических путей и разработала процесс на биологической основе под названием BioPDO для производства 1,3-пропандиола из глюкозы. Компания Genencor работает во многих отраслях биотехнологий; она разрабатывает и продает на промышленном и иных рынках биокатализаторы, а также другие биохимикаты.
PDO представляет собой мономер, используемый при производстве 1,3 пропандиол терефталата, уникального полиэфира производства компании Dupont, который в свою очередь используется при создании ткани, известной как Sorona. PDO традиционно производится посредством длительного, дорогостоящего синтетического метода из нефтяного сырья. Известные методы производства PDO не подходили для промышленного производства, так как для них требовалось большое количество энергии и дорогие начальные материалы. Ученые компаний Genencor и DuPont использовали генную инженерию для совмещения ДНК нескольких различных микроорганизмов в одну производственную линию. При этом возможно преобразование базового углеродного источника в нужный конечный PDO-продукт, рис. 1.

Рис. 1. PDO, созданный при использовании методики Genencor International.

Для создания метаболического пути между глюкозой и PDO был выбран немутированный тип штамма бактерии E. Coli. Так как E. coli в обычных условиях не производят 1,3-пропандиол, пришлось не только модифицировать метаболизм E. Coli, но также импортировать в бактерию соответствующие гены других организмов. Был создан нестандартный и уникальный процесс, заключающийся в совмещении в одном организме-хозяине природного биологического цикла, присущего дрожжам, для производства глицерина из дигидроксиацетона (нормальный метаболит E. Coli), и цикла, присущего бактерии Klebsiella pneumoniae, для преобразования глицерина в PDO. Осуществление процесса конструирования потребовало применения самых современных технологий, а также разработок нескольких новых молекулярно-биологических инструментов, которые позволили осуществлять тонкую регулировку важных путей, устранить ненужные ферменты и аккуратно отрегулировать дополнительные системы клеточной фабрики, основанной на E. coli. Генетические модификации, которые было необходимо произвести в E. coli, первоначально определялись при помощи математических моделей, с использованием которых была создана карта процесса. После того, как была завершена разработка процесса производства PDO, ученые занялись тонкой регулировкой организма-хозяина для максимально эффективного производства продукта. В конечном итоге из E. coli был выведен производственный организм с прямыми модификациями в 18 генах, который производит PDO в объеме 135 г/л при скорости 3,5 г/л/ч при значительной биотехнологической выработке 51%, что означает 500-кратное увеличение биотехнологической производительности.

Рис. 2. Выработка PDO - Genencor International.

Рабочая группа DuPont/Genencor, ответственная за разработку BioPDO, получила положительную оценку от EPA (Агентство по охране окружающей среды США) и была удостоена награды «Presidential Green Chemistry». Компания DuPont и другой ее партнер по производству, Tate & Lyle, завершили работу над процессом производства PDO, основанном на биотехнологии, и создали совместное предприятие, DuPont Tate & Lyle BioProducts LLC. Совместное предприятие использовало разработанный ими совместно и запатентованный процесс культивирования и очищения для выработки 1,3-пропандиола в рамках коммерческого производства PDO (завод стоимостью 100 миллионов фунтов, Лудон, штат Теннеси), главного компонента полимера Sorona от компании DuPont.